40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью в своей вилле. Действие игры начинается в 1499 году. Фамильная резиденция рода Аудиторе Монтериджони (англ. Monterigoni) осаждена наёмниками семьи Борджиа. Осаду проводит сын Родриго Чезаре Борджиа. В осаде, на глазах у Эцио, погиб его родной дядя Марио. После этого действие игры переносится в 1503 год где Эцио, уже как глава Ордена Ассасинов, пытается найти убийц своих родственников и отомстить им, а также вернуть Риму былой мир, порядок и процветание. В будующем Дезмонт, Люси, Шон и Ребекка прибывают в Монтериджони. Они должны пройти подземные тунели и устроить укрытие в Святилище под виллой Аудиторе.